KULTUR JARINGAN (BAGIAN 2 : PEMBUATAN MEDIA)

KEGIATAN 2

PEMBUATAN MEDIA

I. PENDAHULUAN

A.     Latar Belakang

Selain peralatan kultur jaringan, media merupakan salah satu factor utama dalam keberhasilan kultur. Media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam.

Media kultur jaringan memiliki karakteristik masing-masing. Artinya tidak semua media dapat digunakan pada semua kultur tanaman. Karena beberapa media yang ada memiliki perbedaan knadungan dan konsentrasi zat-zat yang diperlukan atau digunakan pada kultur.

B.    Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk:

1. Mengetahi dan mempraktikan cara membuat larutan stok
2. Mengetahui dan mempraktikan cara membuat medium MS (Murashige & Skoog)
3. Melakukan sterilisasi medium

II. TINJAUAN PUSTAKA

Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin kebutuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuhan. Berhasilnya kultur jaringan banyak ditentukan selain kondisi aseptic juga oleh media tanam. Campuran media yang satu, dapat cocok untuk jenis tanaman tertentu, tetapi dapat kurang cocok untuk jenis tanaman yang lain.

Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni, tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh, garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulul dilarutkan dalam konsentrasi tertentu, sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Rahardja, 1995)

Untuk memenuhi factor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang baik mengandung (Anonimous, 2009) :

1.       Hara anorganik. Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur – unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur.

2.       Hara organic. Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan.

3.       Sumber karbon. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.

4.       Agar. Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media.

5.       pH. media biasanya diatur pada kisaran 5.6 – 5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat.

6.       Zat Pengatur Tumbuh. Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh akan dibahas tersendiri pada minggu 13.

7.       Air. distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan organik dan non-organik pada media.

8.       Pemilihan Media. Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil.

III. METODE PRAKTIKUM

A.       Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada acar pembuatan media ini adalah magnetic stirrer, timbangan analitik, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, gelas kimia, pipet makro, pipet mikro dan pipet tetes, pengaduk, pemanas kompor, pH meter, botol kultur, autoklaf, aluminium foil, plastic seal. Sedangkan bahan yang digunakan antara lain media MS dengan kandungan unsure makro, unsure mikro, besi, vitamin, ZPT berupa Kinetin dan IAA, bahan pemadat berupa agar “Swallow”, Sukrosa, KOH atau NaOH 1M, dan HCL 1M.

B. Prosedur Kerja

1.  Pembuatan larutan stok

a.         larutan stok a merupakan larutan hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan dalam 1000 ml aquades.

b.         Larutan stok B merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dilarutkan dalam 100 ml aquades.

c.          Larutan stok C merupakan campuran FeSO₄.7H₂O dan Na₂-EDTA. Dibuat 100 kali dan dilarutkan kedalam 200 ml aquades.

d.         Larutan stok D merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali kedalam 200 ml aquades.

e.         Larutan stok E merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan kedalam 100 ml aquades.

f.          Larutan stok F merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali kedalam 500 ml aquades.

2.   Pembuatan Media kultur

a.         Aquades Sebanyak 500 ml dipersiapkan didalam Erlenmeyer ukuran 1000 ml. larutan stok A, B, C, D, E, dan F dimasukan kedalam Erlenmeyer sesuai dengan yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok A diambil sebanyak 100 ml, stok B diambil 5 ml, stok C diambil 5 ml, stok D diambil 50 ml, stok E untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1 ml. semau bahan tersebut dicampur hingga merata.

b.         b.30 gr sucrosa ditambahkan ke dalam gelas ukur dan biarkan sampai homogen.

c.          Aquades ditambahkan ke dalam gelas ukur sampai volumenya mencapai 1000 ml.

d.         d.pH media diukur dengan pH meter yaitu dengan memasukkan sensor ke dalam larutan media. Jika kurang dari 5,6-5,8 ditambahkan larutan NaOH dan jika lebih ditambahkan larutan HCL.

e.         Masing-masing Larutan media dimasak dengan kompor dan ditambahkan 350 gr agar-agar.

f.          Media dimasukkan ke dalam botol kultur Kira-kira tingginya 2-3 cm, kemudian botol kultur ditutup lagi.

3.   sterilisasi media

a.       botol yang sudah berisi medium, dimasukan kedalam autoklaf untuk disterilisasi pada suhu 121⁰C dengan tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.

b.      Setelah selesai sterilisasi, botol disimpan diruangan yang sejuk.

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A.    Hasil Pengamatan

 Media Murashige & Skoog padat.

B.    Pembahasan

Pembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat. Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya, unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT 100 kali. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan beum mampu menghasilkan asimilat seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar “swallow” untuk memadatkan media.

Laritan stok Fe dibuat dengan dilarutkan menggunakan alcohol absolute atau alcohol 90-96 %. Karena bahan yang digunakan untuk membuatan laruten stok Fe sukar larut. Atau untuk memudahkan dapat pula dibakar atau dipanaskan.

Pembuatan larutan stok pada dasarnya ditujukan untuk menyediakan bahan-bahan yang diperlukan pada pembuatan media dengan konsentrasi yang tepat. Karena media-media yang digunakan pada kultur jaringan diperlukan unsure-unsur dengan konsentrasi yang sangat kecil. Karena tidak dimungkinkan menimbang unsure dengan konsentrasi yang sangat kecil, maka dibuat lah larutan stok dengan menggunakan konsep kalibrasi, sehingga pada pembuatan media, unsure-unsur tersebut dapat digunakan seusia dengan konsentrasi yang diinginkan (Sriyanti, 2002).

Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Menurut Anonim (2009) ada beberapa cara sterilisasi media diantaranya adalah:

A. Sterilisasi Media Menggunakan Autoklaf Portable, dapat dilakukan dengan prosedur sebaga berikut:

(Pemanasan menggunakan api)

1.         Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar

2.         Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.

3.         Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar

4.         Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)

5.         Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.

6.         Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen.

7.         Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.

8.         Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave.

9.         Tutup katup pengeluaran uap.

10.      Amati kenaikan temperature dan tekanan.

11.      Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan.

12.      Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.

13.      Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.

14.      Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up.

15.      Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.

B.   Sterilisasi Aquadest dan Media Menggunakan Autoklaf Listrik (Digital Atau Non Digital)

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang. Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama.

Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009).

V. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:

1.       Pembuatan larutan stok dilakukan dengan mengencerkan menggunakan aquades. unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT berupa IAA dan Kinetin 100 kali.

2.       Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telah dibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1 ml.

3.       Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C pada tekanan 15-17,5 psi selama 20 menit.