KULTUR JARINGAN (BAGIAN 1 : STERILISASI PERALATAN)

KEGIATAN 1

STERILISASI PERALATAN

I. PENDAHULUAN

 

      Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007).

Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemampuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.

Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutapa pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.

B.      Tujuan

Tujuan dari acara ini adalah untuk meningkatkan ketrampilan mahasiswa dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan menggunakan autoklaf.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Sebagai syarat mutlak suksesnya kultur jaringan tanaman, biasanya sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Bahkan autoklaf juga dapat digunakan untuk sterilisasi media tumbuh kultur jaringan. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi sangatlah beragam macamnya, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram) (Gunawan, 1988).

Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan dari autoklaf ini adalah bahwa perlu adanya penjagaan dan pengaturan panas secara manual dan terkontrol, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan, yaitu: lebih sederhana sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Biasanya untuk laboratorium komersial, menurut Gunawan (1988), diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi serta waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable (memiliki program yang dapat diatur), panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

III. METODE PRAKTIKUM

A.        Alat dan Bahan

                Bahan dan peralatan yang digunakan pada acara praktikum ini antara lain autoklaf, kompor serta gas, peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish, gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel), aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus, plastic seal.

B.        Prosedur Kerja

1.         Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil.

2.         Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 120^oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

3.         Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan selama tiga kali.

4.         Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk membuang uap air hingga tekanan 0 psi.

5.         Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.

6.         Peralatan disimpan di tempat yang bersih.

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A.     Hasil Pengamatan

 Beberapa peralatan yang disterilisasi menggunakan autoklaf diantaranya adalah:

1.       Petridish: digunakan sebagai tempat peletakan potongan eksplan di LAF sebelum dilakukan penanaman.

2.       Botol Kultur: digunakan sebagai botol tempat ditanamnya eksplan.

3.       Erlenmeyer: digunakan untuk menyimpan larutan stok.

4.       Scalpel: digunakan untuk memotong eksplan.

5.       Pinset: digunakan untuk menjapit eksplan

6.       Aluminium Foil: digunakan untuk menutup botol kultur maupun untuk melindungi larutan stok dari cahaya matahari secara langsung.

B.     Pembahasan

Alat-alat yang digunakan harus dalam keadaan steril. Karena kondisi yang seteril akan menentukan berhasil tidaknya suatu kegiatan kultur jaringan. Karena jika kondisinya tidak steril, maka akan mudah terkena kontaminasi sehingga kemampuan ttipotensi sel akan terhambat. Alat-alat logam dan gelas yang digunakan pada saat penanaman dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator ataupun pembakar bunsen.

Menurut Anonim (2009), khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121⁰C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Sterilisasi media yang terlalu lama dapat menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.

Bagian-bagian autoklaf :
1. Panci luar.
2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uap.
3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.
4. Katup pengeluaran uap.
5. Pengunci atau klem.

Sterilisasi Peralatan Kultur

1.    Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

2.    Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

3.    Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

4.    Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.

5.    Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121⁰C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai.

V. KESIMPULAN

Berdasarkan data hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa sterilisasi peralatan kultur dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121⁰C pada tekanan 15-17,5 psi. selama 30 menit. Beberapa peralatan yang di sterilisasi menggunakan autoklaf antara lain botol kultur, petridish, Erlenmeyer, aluminium foil, scalpel, dan pinset.